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全部產(chǎn)品液相色譜/質(zhì)譜大氣壓化學(xué)電離源鑒定深海魚油中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸
【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜
摘要 以1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯為衍生化試劑, 在充氮的氣氛下對(duì)魚油進(jìn)行皂化處理, 所得皂化產(chǎn)物經(jīng)正己烷萃取處理后進(jìn)行柱前衍生化, 再以HPLC/MS分離和鑒定。通過(guò)對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸分子的標(biāo)記處理, 其衍生物分子在質(zhì)譜分析中呈現(xiàn)出雙鍵位置的規(guī)范信息。通過(guò)建立模型計(jì)算式, 借助不飽和脂肪酸的分子離子峰和特征碎片離子峰的質(zhì)量數(shù), 計(jì)算不飽和的碳碳雙鍵位置 關(guān)鍵詞 高效液相色譜質(zhì)譜, 柱前衍生, 魚油, 脂肪酸, 雙鍵位置 1 引言 脂肪酸廣泛分布于自然界中，是生物體內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物，對(duì)調(diào)節(jié)生物體內(nèi)各項(xiàng)生理和生物功能起著重要作用。尤其多不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)特征與生理功能的關(guān)系倍受關(guān)注。油脂中脂肪酸的GC/EIMS分析常采用甲酯或三甲基硅烷化，但該法不能確定多不飽和脂肪酸中碳碳雙鍵的位置，因?yàn)樵陔娮愚Z擊下，雙鍵沿脂肪酸鏈明顯遷移[1～3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)柱前衍生以液相色譜/質(zhì)譜（LC/MS/APCI）研究皂化后的深海魚油中脂肪酸的組成，用1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯 (BDEBS)作脂肪酸的柱前衍生試劑[4,5]，采用軟離子化檢測(cè)技術(shù)(大氣壓化學(xué)電離源 2 實(shí)驗(yàn)部分 2.1 儀器與試劑Agilent1100型高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent公司) 2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取定量脂肪酸標(biāo)品，用光譜純乙腈配成1.0×10-2 mol/L的溶液（長(zhǎng)鏈脂肪酸需加入少量DMF作為助溶劑）。稱取0.0404 g的1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯用DMF定容至10 mL，濃度為5.0×10-2 mol/L。相應(yīng)低濃度的衍生試劑(5.0×10-3 mol/L)及低濃度脂肪酸(1.0×10-4 mol/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用DMF和光譜純乙腈稀釋而成。 2.3 深海魚油的皂化和衍生 魚油皂化參考文獻(xiàn)[6]。取100 mg 深海魚油于具塞試管中，加入1.0 mL 2 mol/L KOH的乙醇溶液，充氮密封后，在100℃水浴反應(yīng)0.5 h，取出冷卻至室溫。滴加2.0 mol/L HCl至pH 2.0,加入500 μL正己烷超聲處理2 min，靜止分層，用注射器吸掉水層后，用去離子水洗至pH 7.0。氮?dú)獯蹈�，殘余物重新溶解�?00 μL的乙腈中。向盛有10 mg無(wú)水K2CO3催化劑的2 mL安培瓶中依次加入180 μL DMF，50 μL混合脂肪酸的提取樣，120 μL衍生試劑溶液(5.0×10-3 mol/L)，封口后于85℃恒溫水浴下振蕩反應(yīng)45 min，取出放冷后, 加入1000 μL乙腈水溶液（CH3CN/H2O,1∶1, Ｖ/Ｖ）稀釋后進(jìn)樣10 μL分析。衍生反應(yīng)概況如圖1所示。 2.4 色譜與質(zhì)譜條件Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm，大連依利特公司)。流動(dòng)相A: 50％乙腈水溶液內(nèi)含30 mmol/L的甲酸/氨水緩沖液 (pH3.5)；B: 100％的乙腈。梯度條件：40 min由A到B (B保持10 min),流速為1.0 mL/min, 進(jìn)樣量為10 μL，柱溫30℃。熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為333和390 nm。大氣壓化學(xué)電離源（APCI）：正離子檢測(cè)模式，噴霧壓力60 p.s.i (1p.s.i=6894.76 Pa)，干燥氣流量為5 L/min，干燥氣溫度350℃ 圖1 1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯與5,8,11,14,17二十碳五烯酸的衍生概況及質(zhì)譜斷裂模式(略) Fig.1 Ｓcheme of derivatization procedure using 1,2benzo3,4dihydrocarbazole9ethylbenzenesulfonate (BDEBS) as labeling reagent; and the profile of collisioninduced dissociation of representative derivative of 5, 8, 11, 14, 17eicosapentaenoic acid (C20∶5) 2.5 理論部分（雙鍵位置判定）借助質(zhì)譜分析中所獲得的衍生物分子所對(duì)應(yīng)的分子離子峰的質(zhì)量數(shù)[MH]+（圖1所示） Cn∶0 MH+-1=278+CnH2n-1; n=(MH+-278)/14(1)不飽和脂肪酸： Cn∶1 MH+-1=278+CnH2n-3; n=(MH+-276)/14(2) Cn∶2 MH+-1=278 + CnH2n-5; n=(MH+-274)/14 (3) Cn∶3 MH+-1 = 278 + CnH2n-7; n=(MH+-272)/14(4) Cn∶4 MH+-1 = 278+CnH2n-9; n=(MH+-270)/14(5) Cn∶5 MH+-1 = 278 + CnH2n-11; n=(MH+-268)/14(6) Cn∶6 MH+-1 = 278 + CnH2n-13; n=(MH+-266)/14(7) 公式中n為飽和及不飽和脂肪酸的碳原子數(shù)目；278為試劑分子母核結(jié)構(gòu)部分的分子量；MH+ 為質(zhì)譜確定的飽和及不飽和脂肪酸的分子離子峰的質(zhì)量數(shù)。依據(jù)分子中雙鍵的斷裂模式見圖2。有質(zhì)譜分析中所獲得的不飽和脂肪酸衍生物的特征碎片離子的質(zhì)量數(shù)（雙鍵斷裂后產(chǎn)生的特征碎片離子），含1～6個(gè)碳碳雙鍵的脂肪酸鏈中。 圖2 脂肪酸衍生物中的碳碳雙鍵的質(zhì)譜裂解示意圖(db: 雙鍵; CaH2a:末端雙鍵斷裂所丟失的小分子; CbH2b-2:末端第二個(gè)雙鍵斷裂后丟失的小分子)(略) Fig.2 MS cleavage profile of collisioninduced dissociation of fatty acid derivative (db: double bond; CaH2a: losing of small molecule with the cleavage of double bond at the end of molecular carbon chain) 的雙鍵位置可由下列公式 (8)～(13)計(jì)算獲得： Cn∶1 Cdb= (M+1-276)/14 (8) Cn∶2 Cdb1 = (M+2-276)/14; Cdb2 = (M+1-274)/14(9) Cn∶3 Cdb1 = (M+3-276)/14; Cdb2 = (M+2-274)/14; Cdb3 = (M+1-272)/14(10) Cn∶4 Cdb1= (M+4-276)/14; Cdb2 = (M+3-274)/14; Cdb3 = (M+2-272)/14; Cdb4 = (M+1-270)/14(11) Cn∶5 Cdb1 = (M+5-276)/14; Cdb2 = (M+4-274)/14; Cdb3 = (M+3-272) /14; Cdb4 = (M+2-270)/14; Cdb5 = (M+1-268)/14(12) Cn∶6 Cdb1 = (M+6-276)/14; Cdb2 = (M+5-274)/14; Cdb3 = (M+4-272)/14; Cdb4 = (M+3-270)/14; Cdb5 = (M+2-268)/14; Cdb6 = (M+1-266)/14(13) 公式中的 “dbx”; x = 1, 2,…6 代表雙鍵在脂肪酸碳鏈中的位置，M＋1到 M＋6是雙鍵斷裂后產(chǎn)生的特征碎片離子峰的質(zhì)量數(shù)，實(shí)驗(yàn)中涉及的長(zhǎng)鏈脂肪酸的雙鍵最大數(shù)目為6， 即 x≤6；且有：M＋1＞M+2＞M+3＞M+４＞M＋5＞M+6; 對(duì)同時(shí)含有多個(gè)雙鍵脂肪酸的衍生物，質(zhì)譜上所獲得的特征碎片離子應(yīng)具有M＋1－ M+2＝M＋2－M＋3＝M＋3－M+4＝M+4－M+5＝M+5－M+6＝40個(gè)質(zhì)量單位，參見圖1和圖2。 3 結(jié)果與討論 3.1 質(zhì)譜解析質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明，所有脂肪酸衍生物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的分子離子峰，其質(zhì)量數(shù)為m/z [MH]+；分子離子碰撞裂解后產(chǎn)生的m/z 263.7和 245.7碎片峰為衍生試劑分子的母核結(jié)構(gòu)的特征峰（見圖1）。飽和脂肪酸衍生物，以C14為例（見圖3）：分子離子峰 為474.1，母核結(jié)構(gòu)的特征碎片離子為m/z 263.7和245.7，質(zhì)譜圖中顯示的碎片峰相對(duì)簡(jiǎn)單。含一個(gè)碳碳雙鍵的不飽和脂肪酸衍生物，以C18∶1為例（見圖4）：分子離子峰 為m/z 528.1；失水離子峰m/z [MH]+-H2O (m/z 510.0)，表現(xiàn)出的特征碎片離子峰M+1，m/z 值在444.1，以及與之相鄰并相差12個(gè)質(zhì)量單位的特征峰m/z 456.1。與m/z 444.1相差1～2兩個(gè)質(zhì)量單位的碎片峰m/z 442.6 應(yīng)歸屬于m/z 444.1的峰。依據(jù)等式 (8)，計(jì)算出被裂解雙鍵的首碳位置為 12 (Cdb=12) 圖3 代表性的飽和十四酸(C14∶0) 的質(zhì)譜概況圖 (A: MS分析; B: MS/MS分析)(略) Fig.3 Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of saturated tetradecanoic acid (C14, fatty acid) derivatized with BDEＢＳ as labeling agent 圖4 以12十八碳稀酸為代表的單不飽和脂肪酸衍生物的質(zhì)譜裂解示意圖 (A: MS; B和C為MS/MS)(略) Fig.4 Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of monounsaturated 12octadecenoic acid (C18∶1, fatty acid) derivatized with BDETS as labeling reagent 含多個(gè)碳碳雙鍵的不飽和脂肪酸衍生物 圖 5 以5,8,11,14,17二十碳五烯酸為代表的不飽和脂肪酸衍生物的質(zhì)譜裂解示意圖(略) Fig.5 Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of 5, 8, 11, 14, 17eicosapentaenoic acid (C20∶5) with BDEＢS as labeling reagent Ａ． ＭＳ 3.2 衍生條件優(yōu)化及魚油樣品分離1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯與脂肪酸的衍生化隨溶劑不同衍生化產(chǎn)率有顯著差異 圖6 深海魚油脂肪酸的色譜分離圖 (峰標(biāo)注見表1)(略) Fig.6 Chromatogram of longchain fatty acid derivatives from deepsea fish oil (peaks as in Table 1) 圖7 深海魚油樣品質(zhì)譜離子流圖 (峰標(biāo)注見表1)(略) Fig.7 MS ion chromatogram of the isolated fatty acid derivatives from deepsea fish oil (peaks as in Table 1) 表1 深海魚油中脂肪酸衍生物的質(zhì)譜解析數(shù)據(jù)(略) Table 1 MS analysis of the fatty acid derivatives from deepsea fish oil sample References 1 Mocloskey J A. 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