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全部產(chǎn)品反相高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析合成七肽的消旋產(chǎn)物
關(guān)鍵詞 高效液相色譜質(zhì)譜
1 引言
1963年Merrifield創(chuàng)建了固相多肽合成
RPHPLC具有極高的分辨率
，已廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白的分離。由于多肽在疏水性固定相表面上的吸附與解吸不僅取決于氨基酸序列，而且與其空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，即“疏水腳”的細(xì)微差別將使構(gòu)象不同的多肽具有不同的色譜保留行為[2]。因此，RPHPLC可有效分離序列幾乎完全相同的多肽及多肽的消旋化產(chǎn)物[ 3～5]。本研究對(duì)采用HBTU/Fmoc固相法[6]化學(xué)合成弱疏水性七肽（H2NPFNSLAICOOH）時(shí)出現(xiàn)的消旋產(chǎn)物進(jìn)行了RPHPLC/MS分析：基于適用于不同分離對(duì)象的塔板理論[7]
、Onoff理論[8]和計(jì)量置換理論[9]等已有RPHPLC保留機(jī)理，根據(jù)弱疏水性多肽特性 ，提出“早期吸附”概念，并經(jīng)色譜條件優(yōu)化，得到了峰形良好的譜峰。通過(guò)將不同MSn條件下所得離子碎片和豐度信息進(jìn)行選擇性疊加[10]，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一多肽的一級(jí)測(cè)序，由此成功分析了合成七肽的4個(gè)消旋產(chǎn)物，為消旋化檢測(cè)提供了一種新方法。2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器和試劑
高效液相色譜系統(tǒng)(大連依利特分析儀器有限公司),包括P200Ⅱ型高壓恒流泵
、UV200Ⅱ紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和Echrom98色譜工作站。色譜柱：Lichrosorb RP18, 粒徑5 μm, 填料孔徑10 nm, 200 mm×4.6 mm（美國(guó)惠普公司）；Lichrospher 100 C18, 粒徑5 μm, 填料孔徑10 nm, 250 mm×4 mm（德國(guó)Merck公司）;液/質(zhì)聯(lián)用儀：電噴霧離子阱質(zhì)譜LCQ Advantage MAX，Bioworks 3.0數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)Thermo Finnigan公司）2.2 色譜條件
流動(dòng)相：A液：水（0.1％TFA）
2.3 質(zhì)譜分析
色譜條件同上
3 結(jié)果與討論
3.1 合成七肽粗品的質(zhì)譜直接進(jìn)樣分析
對(duì)合成七肽粗品用質(zhì)譜注射泵直接進(jìn)樣進(jìn)行全掃描分析
3.2 合成七肽粗品的RPHPLC分析
3.2.1 弱疏水性多肽RPHPLC保留行為解析 RPHPLC中溶質(zhì)保留機(jī)理的預(yù)測(cè)一直是色譜理論研究的熱點(diǎn)
基于吸附機(jī)制提出的Onoff模型認(rèn)為：在多肽及蛋白質(zhì)的RPHPLC分析中
對(duì)于實(shí)驗(yàn)中合成的弱疏水性七肽（親疏水性值按文獻(xiàn)[12]方法計(jì)算為－6.1）
圖１ 引入“早期吸附”合成七肽的色譜圖（略）
Fig.１ Chromatogram of heptapeptide with preadsorption
B%為流動(dòng)相中B液的體積分?jǐn)?shù)（B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)
在相同洗脫條件下，使用３支不同塔板數(shù)的C18色譜柱分析該七肽
圖2 舍棄“早期吸附”的合成七肽色譜圖（略）
Fig.2 Chromatogram of heptapeptide without preadsorption
B%為流動(dòng)相中B液的體積分?jǐn)?shù)(B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
圖３ ３支不同塔板數(shù)的C18色譜柱分析（略）
Fig.３ Analysis using three C18 chromatographic columns with different plate numbers
1. Lichrosorb RP18（10 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm） 塔板數(shù)(plate numbers)=6000; 2. Lichrosorb RP18（5 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm） 塔板數(shù)(plate numbers)=12000; 3. Lichrospher100 C18（5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm） 塔板數(shù) (plate numbers)=15000
。3.2.2 RPHPLC分析條件優(yōu)化 首先用純乙腈和純水組成的梯度洗脫體系分析合成七肽粗品（圖４A），峰1（圖中標(biāo)識(shí)）未得到理想分離；隨后不斷降低梯度斜率，以使峰1與其它譜峰分開，得到一系列色譜圖（圖４B、４C、４D）。由圖可知：隨著梯度斜率的緩慢降低，分離度得到改善，但峰形逐漸變鈍，并發(fā)生托尾。這說(shuō)明疏水性蛋白和多肽對(duì)有機(jī)改性劑的變化較為敏感[13]；相反弱疏水性小肽（即本文所合成七肽的消旋產(chǎn)物
圖4 不同梯度條件下的合成七肽（弱疏水性肽）色譜圖（略）
Fig.4 Chromatograms of heptapeptides (i.e. weak hydrophobic peptides) at different gradient elution conditions
B%為流動(dòng)相中B液的體積分?jǐn)?shù)(lichrospher100 C18, 5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm; B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
在流動(dòng)相中加入0.1%的TFA
3.3 液質(zhì)聯(lián)用對(duì)合成七肽消旋產(chǎn)物的測(cè)序分析
首先采用LC/ESI/MS對(duì)圖５中的4個(gè)譜峰進(jìn)行全掃描
在進(jìn)行MS2測(cè)序時(shí)
，很難在同一質(zhì)譜條件下得到全部碎片信息。不同條件下得到的圖譜在碎片離子峰的多少和信號(hào)強(qiáng)弱的分布區(qū)域等方面具有一定的互補(bǔ)性，可以有選擇地將譜圖疊合起來(lái)進(jìn)行分析，從而達(dá)到簡(jiǎn)化串聯(lián)質(zhì)譜解析和提高多肽測(cè)序準(zhǔn)確性的目的[10]。圖６為二級(jí)質(zhì)譜分析中合成七肽的b軸和y軸片段信息，由此確定了合成七肽的4個(gè)消旋產(chǎn)物。圖５ 合成七肽最優(yōu)色譜圖（略）
Fig.５ Optimized chromatogram of heptapeptide
圖６ 譜圖疊加后的合成七肽MS2分析（略）
Fig.６ MS2 analysis of heptapeptide by spectrum superposition
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。粒铣善唠腷軸與y軸斷裂碎片示意圖(b and y fragment ions of synthsized heptapepetide); B. 合成七肽MS2譜圖(MS2 spectrum of synthesized heptapepetide)。3.4 小結(jié)
本研究對(duì)采用HBTU/Fmoc固相法化學(xué)合成弱疏水性七肽（H2NPFNSLAICOOH）時(shí)出現(xiàn)的消旋現(xiàn)象進(jìn)行了RPHPLC/MS分析：（1）討論了弱疏水性七肽在RPHPLC中保留機(jī)理的特殊性
，基于塔板理論、onoff理論和計(jì)量置換理論提出了“早期吸附”概念，以此優(yōu)化色譜條件可充分利用分配和吸附雙重保留機(jī)制來(lái)改善分離效果，并最終得到4個(gè)峰形良好的色譜峰；（2）質(zhì)譜直接進(jìn)樣分析表明：4譜峰具有相同的m/z 761.5 [M＋H]+ 值，與目標(biāo)多肽分子量760.9吻合，對(duì)應(yīng)于合成七肽的4種消旋產(chǎn)物；（3）對(duì)每一譜峰進(jìn)行在線多肽測(cè)序，將不同MS2條件下的離子碎片和豐度信息進(jìn)行選擇性疊加，得到b軸和y軸的碎片信息，成功地分析了合成七肽的4個(gè)消旋產(chǎn)物。References
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本文系國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.20306023）
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。ㄌ旖虼髮W(xué)化工學(xué)院化學(xué)工程研究所，天津 300072）（天津天士力集團(tuán)
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