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              液相色譜儀檢定中常見的影響因素及解決方法

              時(shí)間:2012-3-1 16:24:53作者:admin

              1.氣泡

              由于HPLC系統(tǒng)中氣泡的存在

              ,會(huì)造成色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪聲峰,嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成分析靈敏度下降
              ;氣泡變大進(jìn)入流路或色譜柱時(shí)會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或不穩(wěn)定
              ,使基線起伏。造成上述現(xiàn)象的主要原因有三條:一是流動(dòng)相溶液中往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡
              ;二是系統(tǒng)開始工作時(shí)未能將流路中的空氣驅(qū)趕干凈
              ;三是在注入樣品時(shí)不注意混入了空氣。

              為了避免這類問題的出現(xiàn)

              HPLC實(shí)際分析過程中必須重視對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣處理
              ;在
              HPLC系統(tǒng)開始工作前,可以用注射器連接恒流泵的排空閥
              ,抽入流動(dòng)相
              ,將流路中的空氣驅(qū)趕干凈;在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣

              2.柱溫

              在操作HPLC時(shí)

              ,色譜柱是在室溫環(huán)境下工作的。大多數(shù)的工作環(huán)境溫度是不斷變化的,溫度的差別就會(huì)引起較復(fù)雜的問題
              。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的
              HPLC方法中的洗脫方式受溫度的影響。

              等度洗脫時(shí)溫度會(huì)影響保留時(shí)間

              ,當(dāng)溫度升高時(shí)所有的色譜峰都前移了
              ,等度洗脫時(shí)一般溫度每升高1,保留時(shí)間會(huì)縮短(1~3)
              。溫度變化對(duì)梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢(shì)是一樣的
              。溫度變化對(duì)梯度洗脫的影響要小于對(duì)等度洗脫的影響。即便如此
              ,若梯度洗脫時(shí)不控制溫度的話
              ,保留值一般也會(huì)有較大的變化。溫度變化還可能引起選擇性顯著變化

              正如柱子不能完全平衡將導(dǎo)致保留時(shí)間的重現(xiàn)性差一樣

              ,柱溫不平衡也會(huì)導(dǎo)致不理想的后果,這個(gè)問題在峰寬上的影響尤其明顯
              。當(dāng)溫度變化時(shí)除了選擇性和保留時(shí)間的變化之外
              ,峰寬也會(huì)發(fā)生變化。升高溫度通常會(huì)使理論塔板數(shù)升高
              ,峰寬變窄
              ,由于峰面積不變,峰越窄就會(huì)越高
              ,因此升高溫度可以達(dá)到更小的檢測(cè)限

              柱子里的溫度變化也會(huì)影響峰形。當(dāng)流動(dòng)相和柱子之間的溫差增大時(shí)

              ,由溫度不平衡而導(dǎo)致的峰變形就會(huì)加劇
               

              為了獲得一致的結(jié)果我們必須要控制柱溫,使用柱溫箱是最好的辦法

              。如果沒有柱溫箱
              ,最有效的辦法就是將色譜柱隔絕在一個(gè)溫度波動(dòng)最小的地方。

              3. 色譜柱污染

              色譜柱污染會(huì)引起保留時(shí)間漂移

              HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器
              ,它可以過濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可能是:流動(dòng)相本身
              ,流動(dòng)相容器
              ,連接管、泵
              、進(jìn)樣器和儀器密封墊
              ,以及樣品等

              樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分,就可能使保留時(shí)間漂移

              。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量
              ,在此情況下,保留時(shí)間漂移的同時(shí)或其后會(huì)有反壓的增加
              ?梢酝ㄟ^使用固相提取等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響。

              避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然

              。相比之下
              ,找到問題的所在并設(shè)計(jì)有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑
              ,但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。

              使用保護(hù)柱是個(gè)非常有效的方法

              。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法

              4.色譜柱平衡

              如果我們觀察到保留時(shí)間漂移,首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動(dòng)相完全平衡

              。通常平衡需要10~20個(gè)柱體積的流動(dòng)相
              。但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑則需要相當(dāng)長的時(shí)間來平衡色譜柱。需要柱子的充分平衡
              ,然后才能對(duì)HPLC進(jìn)行檢定

              5.流動(dòng)相有機(jī)溶劑

              HPLC分析總要求使用HPLC純的試劑,關(guān)鍵是兩點(diǎn):純度高

              、紫外吸收小
              。純度高,是希望沒有雜質(zhì)干擾HPLC分析
              ;不會(huì)有金屬離子損害純度為
              99.99%以上的高純度硅膠基質(zhì)
              。可以通過重蒸分析純?nèi)軇
              ;或(yàn)V膜過濾
              ,并定期把前置的過濾頭取下,放稀硝酸里清洗
              ,再用純水洗至中性

              流動(dòng)相有機(jī)溶劑可能影響HPLC的檢測(cè)限。

              6.柱壓

              柱壓過高是HPLC分析中常碰到的問題

              。其原因有多方面
              ,而且常常并不是柱子本身的問題。溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)
              ,這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升
              ,應(yīng)更換柱子入口篩板
              ;泵內(nèi)有空氣,解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣
              ,對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理
              ;比例閥失效,應(yīng)更換比例閥
              ;泵密封墊損壞
              ,應(yīng)更換密封墊;系統(tǒng)檢漏
              ,則找出漏點(diǎn)
              ,密封即可。

              HPLC分析中

              ,在色譜柱正常
              ,樣品靈敏度足夠,分析方法合適
              ,色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下
              ,峰形應(yīng)對(duì)稱而尖銳。充分考慮到可能影響分析結(jié)果的因素
              ,可以科學(xué)地進(jìn)行液相色譜儀的檢定

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